효모 2-하이브리드 시스템은 진핵생물의 유전자 전사 조절을 연구하기 위해 필즈(Fields)와 송(Song)에 의해 처음 확립되었습니다. GAL4, GCN4 등과 같은 일반적인 진핵 전사 인자에는 DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인이라는 두 가지 다른 도메인이 포함되어 있습니다. 전자는 DNA의 특정 서열을 인식하고 전사 활성화 도메인을 이것이 조절하는 유전자의 상류에 위치시킬 수 있습니다. 전사 활성화 도메인은 전사 복합체의 다른 구성요소와 상호작용하여 조절하는 유전자의 전사를 시작할 수 있습니다. 두 도메인은 연결 지역의 적절한 위치에 열릴 수 있을 뿐만 아니라 고유한 기능도 가지고 있습니다. 더욱이, 두 개의 서로 다른 도메인이 재구성되어 전사 활성화 효과를 발휘할 수 있습니다.
중국명
효모 2교배 시스템의 원리
유형
시스템 원리
등< /p>
GAL4
영어
DNA 활성화 도메인
빠른
탐색
장점 응용
p>클래스 II 벡터
효모 2-하이브리드 시스템은 하이브리드 유전자를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 활성화함으로써 단백질 간 상호 작용을 감지합니다. 벡터에는 두 가지 주요 유형이 있습니다: a. DNA 결합 도메인을 포함하는 벡터 b. DNA 활성화 도메인을 포함하는 벡터. 위 두 종류의 벡터를 이용하여 융합 유전자를 구축할 경우, 테스트 단백질 유전자와 도메인 유전자가 리딩 프레임 내에서 융합되어야 합니다. 융합 유전자는 리포터 균주에서 발현되며, 그 발현 생성물은 핵에 국한된 경우에만 리포터 유전자의 전사를 유도할 수 있습니다. 예를 들어 GAL4-bd에는 핵 위치 확인 시퀀스가 있지만 GAL4-ad에는 없습니다. 따라서 SV40의 T-항원 서열은 GAL4-ad의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 핵 국소화 서열로 클로닝되어야 합니다.
장점
2-하이브리드 시스템의 또 다른 중요한 구성 요소는 리포터 계통입니다. 리포터 균주는 리포터 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 포함하는 변형된 숙주 세포를 의미합니다.
가장 일반적으로 사용되는 효모 세포는 효모 세포의 리포터 균주로서 효모 2-하이브리드 시스템에는 많은 장점이 있습니다.
<1> 형질 전환 및 복구가 쉽습니다. 증폭된 플라스미드.
<2>직접 선택할 수 있는 마커 유전자와 특징적인 리포터 유전자를 가지고 있습니다.
<3>효모의 내인성 단백질은 포유류 유래 단백질과 결합하기가 쉽지 않다.
일반적으로 단백질을 코딩하는 유전자는 명확한 전사 조절인자(예: GAL4-bd, LexA-bd)의 DNA 결합 도메인에 융합됩니다. GAL4- 광고, VP16).
활성화 도메인 융합 유전자는 결합 도메인 융합 유전자를 발현하는 효모 세포주로 전달되며, 단백질 간의 상호작용은 전사 인자의 재구성을 일으키고 인접한 리포터 유전자(예: lacZ)를 사용하여 단백질 간의 결합 효과를 분석할 수 있습니다.
응용
효모 2-하이브리드 시스템은 생체 내에서 단백질 결합을 측정할 수 있으며 매우 민감합니다.
주요 원인은 다음과 같습니다.
① 하이브리드 단백질을 과발현하기 위해 복제량이 많고 프로모터가 강한 발현 벡터를 사용합니다.
② 신호 측정은 자연 평형 농도 조건에서 수행됩니다. 그러나 면역 침전과 같은 물리적 방법은 이 조건을 달성하기 위해 여러 번의 세척이 필요하므로 신호 강도가 감소합니다.
③활성화 도메인과 결합 도메인이 결합하여 전사 개시 복합체를 형성함으로써 하이브리드 단백질의 안정성이 강화될 수 있으며, 이는 차례로 프로모터 DNA에 결합합니다. 포인트의 조합은 안정적인 경향이 있습니다.
IV mRNA를 통해 다양한 안정한 효소가 생산되어 신호를 증폭시킨다. 동시에 효모 표현형, X-Gal 및 HIS3 단백질 발현과 같은 검출 방법은 모두 매우 민감합니다.