고효율 액조색보법은 고전색보법을 기초로 기색보 이론을 인용한 것으로, 기술적으로는 유동상이 고압송으로 바뀌었다 (최대 송송 압력은 4.9 에 달할 수 있는가? 107pa); 색보기둥은 특수한 방법으로 작은 지름의 충전재로 채워져 있어 고전적인 액상색보보다 훨씬 효과적이다 (미터당 수만, 수십만에 달할 수 있음). 동시에 기둥 뒤에는 고감도의 탐지기가 연결되어 있어 유출물을 지속적으로 감지할 수 있다.
특징
1. 고압: 액상색보법은 액체를 유동상 (적재액이라고 함) 으로 하고, 액체는 색보기둥을 통과하며 저항이 크므로, 색보기둥을 빠르게 통과하려면 반드시 적재액에 고압을 가해야 한다. 보통 150 ~ 350 × 105pa 까지 가능합니다.
2. 고속: 유동상이 기둥 안에 있는 유속은 클래식 스펙트럼보다 훨씬 빠르며 보통 1 ~ 10ml/min 에 달합니다. 고효율 액조색보법은 클래식 액조색보보다 훨씬 적은 분석 시간을 필요로 하며, 일반적으로 1h 미만이다.
3. 효율성: 최근 많은 신형 고정상이 연구되어 분리 효율이 크게 높아졌다.
4. 고감도: 고감도 검출기는 고감도 액체 크로마토 그래피로 널리 사용되어 분석 감도를 더욱 높였습니다. 형광 감지기 감도가 10-11g 에 달할 수 있습니다. 또한, 작은 샘플, 일반적으로 몇 마이크로 리터 를 사용합니다.
5. 적응범위가 넓음: 기색보법과 고효율 액조색보법의 비교: 기색보법은 분리능력이 좋고, 감도가 높고, 분석속도가 빠르고, 조작이 편리하다는 등의 장점을 가지고 있지만, 기술조건에 따라 끓는점이 너무 높은 물질이나 열안정성이 떨어지는 물질은 모두 기색보법을 적용해 분석하기가 어렵다. 고효율 액조색 스펙트럼은 견본이 용액을 만들 수 있을 뿐 기화는 필요하지 않기 때문에 샘플 휘발성의 제한을 받지 않는다. 고비점, 열 안정성 저하, 상대 분자량이 큰 유기물 (400 이상) (유기물 총수의 거의 75 ~ 80 을 차지하는 유기물) 의 경우 원칙적으로 고효율 액상색보법을 적용하여 분리, 분석을 할 수 있다. 알려진 화합물 중 기색 스펙트럼으로 분석할 수 있는 것은 약 20, 액상색보로 분석할 수 있는 것은 약 70 ~ 80 인 것으로 집계됐다.
고효율 액조스펙트럼은 고정상의 성질에 따라 고효율 젤색 스펙트럼, 소수성 고효율 액조색 스펙트럼, 역상 고효율 액조색 스펙트럼, 고효율 이온 교환 액조색 스펙트럼, 고효율 친화액조색 스펙트럼, 고효율 초점액조색 스펙트럼 등으로 나눌 수 있다. 서로 다른 유형의 고효율 액상색보로 각종 화합물을 분리하거나 분석하는 원리는 기본적으로 그에 상응하는 일반 액상층층의 원리와 비슷하다. 차이점은 고성능 액체 크로마토 그래피가 민감하고 빠르며 해상도가 높으며 반복성이 우수하며 크로마토 그래피에서 수행되어야한다는 것입니다.
고성능 액체 크로마토 그래피의 주요 유형 및 분리 원리
분리 메커니즘에 따라 고성능 액체 크로마토 그래피는 다음과 같은 주요 유형으로 나눌 수 있습니다:
1. 액체-액체 분배 크로마토 그래피 (liquid-liquid partition chromatograph y) 및 화학 결합 크로마토 그래피 (chemically bonded phase chromatograph y)
유동상과 고정상은 모두 액체이다. 유동상과 고정상 사이에는 서로 용해되지 않아야 하며 (극성이 다르기 때문에 고정액의 손실을 방지함), 뚜렷한 인터페이스가 있어야 한다. 견본이 색보열에 들어가면 용질이 두 단계 사이에 분배된다. 균형을 이룰 때 다음 사항에 복종한다.
유형, 고정 상 농도에서 cs-용질; Cm-- 유동상에서의 용질 농도; Vs-고정상의 부피; Vm-이동상의 볼륨. LLPC 는 GPC 와 유사합니다. 즉, 분리 순서는 K, K 의 큰 그룹 보존 값이 크다는 것입니다. 그러나 GPC 에서 흐름은 K 에 비해 영향이 적고 LLPC 흐름은 K 에 비해 영향이 크다는 점도 다릅니다.
A. 정상 액체-액체 분배 크로마토 그래피 (normal phase liquid chromatograph y): 유동상의 극성은 고정액의 극성보다 작다.
B. 역액-액체 분배 크로마토 그래피 (Reverse Phase Liquid Chromatograph Y): 유동상의 극성이 고정액의 극성보다 큽니다.
C. 액체-액체 분배 크로마토 그래피의 단점: 유동상과 고정상의 극성 요건은 완전히 다르지만 고정액은 유동상에서도 미량의 용해가 있다. 유동상이 색보기둥을 통과할 때의 기계적 충격력은 고정액 손실을 초래할 수 있다. 1970 년대 말에 발전한 화학 결합고정상 (뒤 참조) 은 이러한 단점을 극복할 수 있다. 현재 널리 사용되고 있습니다 (70~80).
액체-고체 크로마토 그래피
유동상은 액체이고 고정상은 흡착제 (예: 실리콘, 산화 알루미늄 등) 이다. 이것은 물질 흡착작용에 따라 분리되는 것이다. 그 작용 메커니즘은 샘플이 색상 스펙트럼 기둥에 들어갈 때 용질 분자 (X) 와 용제 분자 (S) 가 흡착제 표면 활성 센터 (미처리 시 모든 흡착제 활성 센터가 S) 에 흡착되어 다음과 같이 표현될 수 있다는 것이다.
Xm+NSA = = = = = = = xa+nsm
형식 중: Xm-- 유동상의 용질 분자; Sa-- 고정상의 용매 분자; Xa-- 고정상의 용질 분자; Sm-- 유동상의 용매 분자.
흡착 경쟁 반응이 균형을 이룰 때:
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
형식 중: k 는 흡착 평형 상수입니다. [토론: k 가 클수록 보존 값이 커집니다. ]
이온 교환 크로마토 그래피 (Ion-exchange Chromatography)
IEC 는 이온 교환제를 고정상으로 한다. IEC 는 이온 교환 수지에서 이온화 가능한 이온과 유동상에서 같은 전하를 가진 용질 이온을 기준으로 역교환해 교환제로 서로 다른 친화력을 가지고 분리한다.
음이온 교환제를 예로 들면, 그 교환 과정은 다음과 같이 표현할 수 있다.
X- (용제 중)+(수지 -R4N+Cl-)=== (수지 -R4N+ X-)+Cl- (용제 중)
교환이 균형을 이룰 때:
Kx = [-r4n+x-] [cl-]/[-r4n+cl-] [x-]
분배 계수는
입니다Dx = [-r4n+x-]/[x-] = kx [-r4n+cl-]/[cl-]
[토론: DX 와 보존 값의 관계 ]
용제에서 이온화할 수 있는 물질은 보통 이온 교환 색상 스펙트럼으로 분리할 수 있다.
이온 쌍 크로마토 그래피 (Ion Pair Chromatography)
이온 쌍 색상 스펙트럼은 용질 분자 전하와 반대되는 이온 (이온 또는 반이온이라고 함) 을 흐름상이나 고정상에 추가하여 용질 이온과 결합하여 소수성 이온 쌍 화합물을 형성하여 용질 이온의 보존 동작을 제어하는 것이다.
원리는 다음과 같이 표현할 수 있습니다:
X+ 수성+Y- 수성 === X+Y- 유기상
형식 중: X+ 수성-유동상에서 분리할 유기이온 (양이온); Y- 수성-유동상에서 반대 전하를 띤 이온 쌍 (예: 수산화 사부틸암모늄, 수산화 세틸 트리메틸 암모늄 등); X+Y--- 형성된 이온 쌍 화합물.
균형을 이룰 때:
KXY = [X+Y-] 유기상 /[ X+] 수상수 [Y-] 수상수
정의에 따라 분배 계수는
입니다DX= [X+Y-] 유기상 /[ X+] 수상수 = KXY [Y-] 수상수
[토론: DX 와 보존 값의 관계 ]
이온 쌍 크로마토 그래피 (특히 역상) 는 산, 알칼리 및 이온, 비이온 혼합물, 특히 핵산, 뉴클레오티드, 알칼로이드, 약물 등 이전에는 분리하기 어려웠던 혼합물의 분리 문제를 해결합니다.
이온 크로마토 그래피 (Ion Chromatography)
이온 교환 수지를 고정상으로, 전해질 용액을 유동상으로 사용한다. 컨덕턴스 검출기를 범용 검출기로 사용하여 유동상에서의 강한 전해질 배경 이온이 컨덕턴스 검출기에 미치는 간섭을 제거하기 위해 억제 기둥을 설정합니다. 샘플 그룹이 분리 기둥과 억제 기둥에 반응하는 원리는 이온 교환 색상 스펙트럼과 같다.
음이온 교환 수지 (R-OH) 를 고정상으로 사용하여 음이온 (예: Br-) 을 분리하는 경우를 예로 들 수 있습니다. 음이온 Br- 유류상 (NaOH) 을 따라 색상 스펙트럼 기둥에 들어갈 때 다음과 같은 교환 반응 (용리반응이 교환반응의 역과정임) 이 발생합니다.
기둥에서 발생하는 반응 억제:
R-H++Na+OH- === R-Na++H2O
R-h++na+br-= = r-na++h+br-
기둥을 억제하여 세제를 컨덕턴스 값이 작은 물로 전환함으로써 본저전도의 영향을 제거한 것을 알 수 있다. 샘플 음이온 Br- 은 상응하는 산 H+BR 로 변환되어 전도법으로 예민한 감지를 할 수 있다.
이온 크로마토 그래피는 용액 중 음이온 분석을 위한 가장 좋은 방법이다. 양이온 분석에도 사용할 수 있습니다.
6. 공간 배제 크로마토 그래피 (steric exclusion chromatograph y)
공간 배제 크로마토 그래피는 겔 (gel) 을 고정상으로 사용합니다. 그것은 분 자체의 역할과 비슷하지만, 젤의 구멍 지름은 분 자체 보다 훨씬 더 크다, 일반적으로 나노미터에서 나노미터 수백 나노미터. 용질은 상호작용력의 차이에 따라 분리되는 것이 아니라 분자 크기에 따라 분리된다. 분리는 젤의 구멍 지름 분포와 용질의 유동 역학 볼륨 또는 분자 크기와만 관련이 있습니다. 견본이 색상 스펙트럼 기둥에 들어간 후, 흐름상에 따라 젤 외부 간격과 구멍 옆을 통해 흐른다. 샘플 중 너무 큰 분자는 접착제에 들어갈 수 없어 저항을 받기 때문에 직접 기둥을 통과해 먼저 스펙트럼도에 나타나고, 작은 분자는 모든 고무구멍에 들어가 알갱이에 침투할 수 있다. 이 그룹들은 기둥에서 가장 큰 유지값을 유지하며 스펙트럼도에 마지막으로 나타난다.
고성능 액체 크로마토 그래피는 주로 주입 시스템, 주입 시스템,. 분리 시스템, 검출 시스템 및 데이터 처리 시스템을 갖추고 있으며, 각 구성 및 특성은 아래에 설명되어 있습니다.
1. 샘플 시스템
일반적으로 다이어프램 사출 샘플러 또는 고압 샘플러를 사용하여 샘플 작업을 완료합니다. 샘플 양은 일정합니다. 이것은 분석 샘플의 반복성을 높이는 데 유익하다.
주입 시스템
이 시스템에는 고압 펌프, 이동상 메모리 및 그라데이션 세 부분이 포함되어 있습니다.
고압펌프의 일반 압력은 l．47～4．4X107Pa 로 유속 조절이 가능하고 안정적이며, 고압유동상이 층층 기둥을 통과할 때 기둥의 샘플 확산 효과를 낮추고 기둥에서의 이동 속도를 높일 수 있어 해상도 향상, 샘플 재활용, 샘플의 생체 활성 유지 등에 유리하다. 흐름상 저장 오류 및 그라데이션기는 용리액의 극성, 이온 강도, PH 값 변경, 경쟁 억제제 또는 트랜스젠더로 전환 등 고정상 및 샘플의 성질에 따라 흐름을 변경할 수 있습니다. 이렇게 하면 다양한 물질 (단 하나의 기단의 차이나 이종체만 있어도) 을 효과적으로 분리할 수 있다.
3. 시스템 분리
이 시스템에는 스펙트럼 기둥, 연결관, 온도 조절기 등이 포함됩니다. 스펙트럼 기둥의 일반적인 길이는 10 ~ 50cm (두 개의 연결이 필요할 때 둘 사이에 연속 인계를 추가할 수 있음) 이며, 내경은 2 ~ 5mm 로, "양질의 스테인리스강이나 두꺼운 벽유리관 또는 티타늄 합금 등의 재료로 만들어졌으며, 내부에는 지름이 5 ~ 10μ m 입도가 있는 고정상 (기질과 고정액으로 구성됨) 이 들어 있다. 고정상의 기질은 ) 및 표면적보다 큰 특징, 그리고 표면이 기계적 얼룩 (기색 스펙트럼의 고정상과 같은 준비) 을 거치거나 화학법으로 각종 유전자 (예: 인산기, 계민기, 메틸기, 페닐, 아미노 또는 다양한 길이의 탄소사슬의 메탄기 등) 또는 리간드의 유기화합물을 결합한다. 따라서 이러한 고정은 상대적으로 구조가 다른 물질에 대해 좋은 선택성을 가지고 있다. 예를 들어, 다공성 실리콘 표면에 완두콩 렉틴 (PSA) 을 결합한 후에는 섬유세포 중 하나인 글리코겐을 분리할 수 있습니다.
또한 고정상 기질이 작고 기둥 침대는 균일하고 촘촘한 상태에 이르기 때문에 소용돌이 확산 효과를 쉽게 낮출 수 있습니다. 기질의 입도는 작고, 미공은 얕으며, 샘플은 미공구 내에서 전도가 짧다. 이것들은 스펙트럼 폭을 줄이고 해상도를 높이는 데 유익하다. 기둥 효과 이론 분석에 따르면 기질의 세분성이 작을수록 탑판 이론의 수 N 이 커진다. 이것은 또한 기질의 세분성이 작아서 해상도를 높일 수 있다는 이치를 더욱 증명한다.
또한, 고성능 액체 크로마토 그래피의 온도 조절기는 온도를 실온에서 60C 로 조절할 수 있으며, 물질 전달 속도를 향상시키고 분석 시간을 단축함으로써 단층 기둥의 효율을 높일 수 있습니다.
4. 테스트 시스템
고효율 액조 색상 스펙트럼에 일반적으로 사용되는 탐지기는 자외선 탐지기, 시차 접기 탐지기, 형광 감지기 세 가지입니다.
(1) 자외선 검출기
이 감지기는 자외선 (또는 가시광선) 에 흡수 성능 샘플이 있는 테스트에 적합합니다. 특징: 사용 범위가 넓다 (예: 단백질, 핵산, 아미노산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 호르몬 등 모두 사용 가능). 감도가 높다 (검출 하한은 10-10g/ml); 선형 범위 폭 온도와 유속의 변화에 민감하지 않습니다. 그라데이션 용액 세탁을 감지할 수 있는 샘플.
(2) 차동 굴절 검출기
흐름과 굴절률이 다른 샘플 그룹은 모두 시차 접기 탐지기를 사용하여 감지할 수 있습니다. 현재 당류 화합물의 검사는 대부분 이 검사 시스템을 사용한다. 이 시스템은 공통성이 강하고 조작은 간단하지만 감도가 낮으며 (검출 하한은 10-7G/ML), 흐름상의 변화로 인해 굴절률이 바뀌므로 추적 분석이나 그라데이션 용출 샘플 검사에는 적용되지 않습니다.
(3) 형광 검출기
형광을 가진 모든 물질은 일정한 조건 하에서 빛을 방출하는 형광 강도가 물질의 농도에 비례한다. 따라서 이 탐지기는 형광이 있는 유기화합물 (예: 다환 방향족, 아미노산, 아민, 비타민, 일부 단백질 등) 의 측정에만 적용되며 감도가 매우 높고 (검출 하한은 10-12 ~ 10-14G/ML), 미량 분석과 그라데이션 용출 작품의 검사를 모두 사용할 수 있다
(5) 데이터 처리 시스템
이 시스템은 샘플을 분리, 준비 또는 검증할 수 있도록 테스트 데이터를 수집, 저장, 표시, 인쇄 및 처리할 수 있습니다.
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