Western blot 실험에서 가장 일반적인 10 가지 문제와 해결책

1, Western Blot 원리

Westernblot 의 원리는 단백질이 전력장의 작용으로 큰 것부터 작은 것까지 배열되어 전기 영동을 이용하여 분리와 부를 축적한다는 것이다. 에피토프를 가진 단백질 분자는 항체 (일항) 이성에 의해 식별되어 결합되었다. 이를 바탕으로 효소나 형광마크의 이항 인식과 일항이 결합되어 밑물과 발색하여 목적단백질을 관찰한다.

Westernblot 색상을 지정하는 방법은 주로 (1) 자체 방사 현상, (2) 기질 화학 발광 ECL, (3) 저물 형광 ECF, (4) 저물 DAB 색입니다. 현재 흔히 쓰이는 기질 화학발광 ECL 과 기질 DAB 는 색을 띠고 있다. 대부분의 Westernblot 발색 기질은 화학발광 기질로, 문장 발표도 대개 기질 화학으로 ECL

2, 목적 단백질 신호가 약하거나 없음

Westernblot 발광 감지에서 흔히 볼 수 있는 문제 중 하나는 목적단백질 신호가 약하거나 없다는 것이다. 먼저 전막이 불충분한지/과회전을 고려하고, 그렇다면 전막 조건을 최적화해야 한다. 둘째, 전막이 적당하다는 전제하에 항체-항원 민감성이 너무 낮은지, 밑물 HRP 또는 밑물 활성이 낮아질지 여부를 고려해 샘플 증가/항체 농도 증가/민감한 기질 사용/엠보싱 시간 연장을 통해 해결할 수 있다. 젤이 너무 두껍고 노출 시간이 짧으면 단백질 신호가 줄어들기 때문에 전막 시간과 필름의 노출 시간을 늘려야 한다.

3, 비특성 스트라이프

비특이적 밴드는 항체 교차 반응과 관련이 있다. 단항이 다항특이성보다 좋고 순도가 높으며, 또 적당히 일항/이항농도를 희석하는 것도 필요하다. 샘플이 처리 중에 분해되면 샘플 처리 시 단백질 억제제를 넣어 얼음 위에서 조작한다.

4, 현상 후 필름 스트립이 노란색 또는 흰색

HRP 가 너무 높아서 민감성이나 배경이 너무 높을 수 있으므로 항체 농도를 낮춰야 합니다.

5, 밴드 내부에 현상되지 않은 흰색 점

일반적으로 전막과 현상기의 조작과 관련이 있으며, 전막 전에 가능한 한 막의 균형을 맞추고, 접착제와 막 사이에 기포를 피하고, 현상할 때 필름과 엑스레이 사이에도 기포를 피해야 한다.

6, 작은 반점에 흩어져있는 존재

우유 폐쇄액 중의 불순물 입자로 인해 이런 문제를 해결하면 폐쇄액을 미리 구성해 4 도에 보관할 수 있고, 사용할 때는 섞지 말고 상층만 사용할 수 있다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 우유명언)

7, Western Blot 화학발광 (ECL) 경화 원인?

Western Blot' 급냉' 의 원인은 주로 HRP 가 포함된 항체 및 발광 시약 두 가지입니다. 어떤 발광 시약 의 장기적 인 응용 으로 인해 사람들 은 항체 에 더 많은 관심 을 했 고, 발광 시약 도 사실 에 대한 실험 결과 에 중대한 영향 을 끼칠 수 있다는 것 을 알 수 없다. 항체 방면에서, 항체 농도를 적당히 낮추고, 발광 실험을 할 때 신속하게 조작하여' 경화' 문제를 해결할 수 있다. 발광 시약 의 경우, 발광 안정 의 발광 시약 를 선택 하여' 담금질' 의 문제 를 해결할 수 있다.

8, Western Blot 배경이 너무 높음

배경 깊이는 Western blot 발광 감지에서 가장 흔한 문제이며, 배경 깊이를 유발하는 데에는 여러 가지 이유가 있습니다. 첫째, 폐쇄적인 문제는 폐쇄조건이 보통 5 우유나 BAS 실온에서 2-4 시간 닫히지만, 4 시간 밤을 보내는 것이 좋다. 실제로 우유는 대부분의 항체 들에게 효과가 좋지만, 이항과 우유는 교차반응이 있을 수 있으므로 세탁이 중요하다. 또한 BSA 단백질 단일은 우유의 다른 성분으로 인한 배경을 낮출 수 있다. 둘째, TBST 세탁이 철저하지 않으면 배경이 깊어질 수 있으며, 세탁시간, 횟수, 사용량을 적절히 늘리면 배경색이 경감될 수 있으며, 때로는 막이 완전히 균일하지 않은 침윤도 원인 중 하나다.

셋째, 스트립 배경 깊이도 노출 시간과 관련이 있으며 노출 시간이 30 분 이상인 배경은 정상이므로 가능하면 1-10 분 노출을 권장합니다. 넷째, 항체 농도가 너무 높으면 배경도 높아 실험 전에 검사를 하는 것이 좋습니다.

9, Western blot 에서 Tween-20 의 역할은 무엇입니까? 어떻게 써야 하나요?

Tween-20 은 비이온형 표면활성제이다. 용도는 수포유 유화제, 용제, 확산제, 안정제, 윤활제, 정전기 방지제 등으로 사용할 수 있습니다. 기색 스펙트럼 고정액 (최대 사용 온도 120 C) 은 휘발유, 지방산에스테르, 알코올, 케톤, 할로겐화물의 분리 분석을 한다. Western blot 의 운영 과정은 대부분 TBST 로션을 사용하며 폐쇄적이며, 일항 이항 부화라는 비교적 중요한 단계입니다. 보통 Tween-20 은 비이온형 표면활성제로 SDS, BSA 와 비슷한 효과를 냅니다. 막에서 결합된 단백질은 일부 세제로 대체되기 때문에 폐쇄할 때 Tween20 을 사용하여 세제를 제거할 수 있고 농도는 0.3(0.05 효과가 가장 좋음) 을 초과하지 않아야 하며, 우유 폐쇄 효과가 좋지 않으면 트웨인의 농도를 높일 수 있다. WB 로션의 트웨인은 BSA 와 마찬가지로 항원 항체 단백질에 보호 작용을 제공하는 동시에 표면활성제 (사반부가 친수된 에폭사이드 그룹 뒤의 화합물) 로 인해 항원에 대한 항체 비특이적 작용을 줄일 수 있다. 결합되지 않은 항체 세척과 비특이적 결합을 줄이는 데 쓰인다. Tween-20 은 TBST 를 사용할 때 Tween-20 의 사용량은 0.5ml/L 이고 SDS 는 없습니다.

10, 변형 스트라이프 발생

젤은 거품이나 불순물, 전류가 불안정하고 젤이 차갑고 고르지 않다. 제교 기구와 전기 수영 탱크는 깨끗하게 유지되고, 새로운 전해질을 교체하여 재료가 오염되지 않도록 하고, 접착제를 만드는 과정에서 기포를 제거한다. 전기 영동 탱크 노화와 같은 새로운 것을 제안합니다. 가능한 중간 구멍을 선택하여 샘플을 추가해 양끝의 견본을 피하세요.