정식 명칭이 헤마톡실린 및 에오신 염색인 HE 염색은 가장 기본적이고 중요한 병리학적 염색 기법이다.
HE 염색은 국내외에서 병리학적 진단에 널리 사용되는 전통적인 염색법이다. 좋은 HE 슬라이드는 정확한 병리학적 진단을 보장하는 열쇠입니다. 절편의 품질은 질병 진단의 적시성과 정확성에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 자격을 갖춘 실험 기술자로서 고품질 HE 염색 단면을 생성할 수 있다는 것은 숙지해야 할 중요한 교훈입니다.
HE 염색의 실험 원리 및 주의사항
1. 핵 염색의 원리:
헤마톡실린은 핵에 색을 입힐 수 있는 알칼리성 천연 염료입니다. 세포핵에 있는 염색질의 주성분은 DNA이다. DNA의 이중나선 구조에서 두 개의 뉴클레오티드 사슬에 있는 인산기가 바깥쪽으로 향하고 있어 DNA 이중나선의 바깥쪽이 음전하를 띠고 산성을 띠게 되어 DNA와 쉽게 상호작용할 수 있다. 양전하를 띤 것. 헤마톡실린 알칼리성 연료는 이온 결합이나 수소 결합으로 얼룩져 있습니다. 헤마톡실린은 알칼리성 용액에서 파란색으로 나타나므로 세포핵이 파란색으로 염색됩니다.
2. 세포질 염색의 원리:
세포질의 주성분은 양성 화합물인 단백질로, 세포질 염색은 pH 값과 밀접한 관련이 있습니다. pH는 단백질 등으로 조정됩니다. 전기점이 4.7-5.0이면 세포질은 외부로 전기를 나타내지 않습니다. 이때 산성이나 염기성 염료는 쉽게 염색되지 않습니다. pH를 6.7~6.8로 맞추면 pH 값이 단백질의 등전점보다 높아져 산성 이온화를 나타내며, 음전하를 띤 음이온이 양전하를 띤 염료에 염색될 수 있게 되어 핵도 염색됩니다. 그리고 세포질은 구별하기 어렵습니다. 따라서 pH를 세포질의 등전점 이하로 조절해야 하며, 염료용액에 아세트산을 첨가하여 세포질을 양전하(양이온)로 만들어 음전하(음이온) 염료로 염색할 수 있도록 한다. 에오신 Y는 물 속에서 음전하를 띤 음이온으로 해리되어 단백질의 양전하를 띠는 아미노 전하(양이온)와 결합하여 세포질, 적혈구, 근육, 결합 조직 및 호산구 등을 염색하는 화학적으로 합성된 산성 염료입니다. 다양한 정도의 빨간색 또는 분홍색으로 감염되어 파란색 세포핵과 뚜렷한 대조를 이룹니다.
3. 분화:
염색 후 특정 특정 용액을 사용하여 조직에 결합된 과잉 염료를 제거합니다. 이 과정을 분화라고 하며, 사용되는 용액을 분화액이라고 합니다. . HE 염색에서는 0.5 염산 에탄올을 분화액으로 사용하는데, 그 이유는 산이 헤마톡실린의 퀴논 구조를 파괴하여 조직이 색소에서 분리되어 퇴색될 수 있기 때문입니다. 헤마톡실린 염색 후 0.5염산에탄올로 감별하여 핵에 과도하게 결합된 헤마톡실린 색소와 세포질에 흡착된 헤마톡실린 색소를 제거해야 하며, 에오신 염색을 통해서만 핵과 세포질 염색의 일관성을 확보할 수 있습니다. . 별개의. 따라서 HE 염색의 분화는 매우 중요한 단계입니다.
4. 청색 복귀 효과:
헤마톡실린은 분화 후 산성 조건에서는 적색 이온 상태로 나타나고 알칼리성 조건에서는 적색 이온 상태로 나타나며, 빨간색. 0.5 염산에탄올로 분화하면 조직절편이 붉은색 또는 분홍색으로 나타나므로 분화 후 즉시 물로 조직절편의 산을 제거하여 분화를 종결시킨 후 약알칼리수(0.2 암모니아수)를 사용하여 헤마톡실린을 만든다. -염색된 세포핵은 파란색으로 나타나는데, 이 과정을 블루잉(Bluing) 또는 블루잉(Bluing)이라고 합니다. 또한 수돗물에 담그는 것도 세포핵을 다시 파란색으로 바꿀 수 있지만 시간이 더 오래 걸립니다.
실험재료
고착제 : 일반적으로 사용되는 95 에탄올과 빙아세톤
헤마톡실린 염료 : 헤마톡실린 분말 0.5g과 암모늄비트리올 24g을 달아 70ml의 물에 녹인다 증류수에 NaIO 31g과 물 5ml를 취하여 글리세린 30ml와 빙초산 2ml를 넣고 균일하게 섞은 후 여과지로 여과하여 따로 둔다.
에오신염료 : 수용성 에오신염료 0.5g을 달아 증류수 100ml에 녹인다.
묽은염산에탄올용액 : 에탄올 75에 염산 1개를 준비한다.
에탄올, 자일렌, 중성 검의 연속 농도입니다.
배양병, 페트리 접시, 안과 겸자, 커버슬립, 슬라이드, 현미경.
실험 단계
시료 준비: 부착성 성장 세포의 경우 트립신으로 분해한 후 세포 농도를 약 1×105/ml로 조정한 후 커버슬립에 떨어뜨립니다. 6 웰 플레이트), 해당 시간 동안 배양한 후 세포를 꺼내어 펼쳐 놓고 PBS로 3회 세척한다.
샘플 고정: 95% 에탄올로 20분간 고정하고 PBS로 1분씩 두 번 세척했습니다.
핵 염색: 헤마톡실린 염료로 2~3분간 염색한 후 수돗물로 씻어냅니다.
색분리 : 현미경으로 관찰하여 세포핵이 너무 짙게 염색된 경우에는 염산알코올 용액 1개를 사용하여 몇 초간 색분리 후 수돗물로 씻어주세요.
세포질 염색: 에오신 염색 용액에 1분 동안 담근 후 수돗물로 씻어냅니다.
세포를 불어 건조하거나 자연 건조시킵니다. 슬라이드에 올라간 후 중성 고무로 슬라이드를 밀봉합니다.
세포가 4-파라포름알데히드로 고정되면 그에 따라 염색 시간도 연장됩니다(헤마톡실린 염색의 경우 12~15분, 에오신의 경우 5분).
실험결과 및 주의사항
** 실험결과**
세포핵은 파란색을 띠고 세포질, 근육섬유, 콜라겐섬유, 적혈구 등이 정도는 다양합니다. 칼슘염과 세균은 파란색 또는 보라색-파란색을 나타낼 수 있습니다.
참고:
1. 염색 시 pH 값을 조정하는 것이 중요합니다. 조직 블록이 포르말린에 오랫동안 고정되어 있으면 조직이 산성화되어 핵 염색에 영향을 미칩니다. 따라서 세포를 수돗물로 오랫동안 헹구거나 포화 탄산리튬 수용액에 10~30분간 처리해야 하는데, 이 경우 세포핵이 어두워질 수 있다. 에오신으로 염색했을 때 세포질이 잘 염색되지 않으면 에오신 용액에 빙초산 1~2방울을 첨가할 수 있습니다.
2. 절편을 헤마톡실린으로 염색한 후 색분리 단계는 매우 중요하며 현미경으로 조절해야 합니다. 일반적으로 핵이 명확하게 염색되고(투명) 세포질이 기본적으로 깨끗한 것이 좋습니다. 무색. 색분리 시간을 너무 연장하면 염색이 너무 옅어지므로 색분리 전에 색을 다시 염색해야 합니다.
3. 슬라이스를 알코올로 탈수시킨 후 자일렌에 넣으면 흰색의 불투명한 상태가 나타날 수 있습니다. 이는 탈수가 불완전하다는 의미입니다. 완전한 탈수 및 탈수를 달성하십시오.