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효모 수크라제의 분리, 정제 및 활성 측정
실험 소개: 효소의 분리 및 제조는 효소학 및 생물학적 거대분자의 구조와 기능 연구에서 매우 중요합니다. 수크라아제는 맥주효모에 풍부하게 함유되어 있습니다. 본 실험은 신선한 맥주 효모를 원료로 사용하여 세포 파괴, 열처리, 에탄올 침전, 컬럼 크로마토그래피 및 기타 단계를 통해 수크라아제를 추출합니다. 그리고 그 활동을 측정합니다.
실험원리
수크라제는 주로 효모에 존재하지만, 산업계에서는 주로 효모에서 생산된다. 효모 수크라아제는 추출 중에 세포 파괴 또는 박테리아 세포 자가분해를 일으키는 세포내 효소입니다. 일반적으로 사용되는 정제 방법에는 염석, 유기 용매 침전, 이온 교환 및 겔 컬럼 크로마토그래피가 포함됩니다. 이러한 방법으로 보다 높은 순도의 효소를 얻을 수 있습니다.
수크라아제는 자당을 같은 양의 포도당과 과당으로 가수분해하는 과정을 촉매합니다. 수크로스 가수분해 속도는 생성된 환원당(포도당과 과당)의 양을 측정하여 측정합니다. 본 실험에서 수크라제의 활성 단위는 특정 조건에서 반응 5분당 1mg의 포도당을 생성하는 데 필요한 효소의 양을 의미합니다. 정황. 단백질 함량은 쿠마시 브릴리언트 블루 방법을 사용하여 결정되었으며, 비활성은 단백질 1mg당 활성 단위의 수였습니다.
실험적 조작
1. 추출
(1) 얼음 욕조를 준비하고 얼음 욕조에 모르타르를 단단히 넣습니다.
(2) 절구에 젖은 맥주효모 10g과 실리카 적당량(5g)을 넣는다. 실리카는 미리 곱게 분쇄해야 합니다.
(3) 미리 냉각된 탈이온수 30mL를 한 번에 약 2mL씩 천천히 첨가하고 첨가하면서 최소 30분 동안 분쇄합니다. 인버타아제를 수상으로 완전히 옮기려면 대부분의 효모 세포가 완전히 분쇄될 때까지 효모 세포를 갈아서 인버타아제를 수상으로 완전히 옮기십시오.
(4) (선택 사항) 분쇄 중 분쇄 효과를 확인하려면 현미경을 사용하십시오.
(5) 혼합물을 2개의 원심분리기 튜브에 옮기고 균형을 맞춘 후 고속냉랭원심분리기, 4°C, 10,000rpm, 5분간 원심분리기를 사용한다.
(6) 점적기로 조심스럽게 수상을 꺼내어 깨끗한 다른 원심분리 튜브에 옮긴 후 4°C, 10000rpm에서 15분간 원심분리합니다.
(7) 투명한 액체를 눈금실린더에 옮겨 부피를 측정하고, 다양한 pH 시험지로 상층액의 pH를 확인하고, 1mol/L 아세트산으로 pH를 5.0으로 조정한다. , 이를 "거친 분수 I"이라고 합니다. 효소 활성과 단백질 함량을 측정하기 위해 1.5 mL를 따로 보관하고 남은 부분을 깨끗한 원심분리 튜브에 옮깁니다.
2. 열처리 및 에탄올 침전
(1) 항온수조를 미리 50℃로 맞추고, 조분획 I이 담긴 원심분리관을 수조에 단단히 넣는다. , 45 ℃에서 30분 동안 배양하고, 배양 과정 동안 원심분리용 튜브를 가볍게 흔든다.
(2) 원심분리용 튜브를 꺼내 얼음조에서 빠르게 식힌 후 4°C, 10,000rpm에서 10분간 원심분리한다.
(3) 상등액을 작은 비커에 옮겨 얼음-소금 욕조에 넣고(물이 없는 분쇄 얼음에 소량의 소금을 뿌린다) 미리 냉각된 95% 동량의 용액을 적가한다. -20°C% 에탄올에 넣고 동시에 천천히 저어주며 30분간 기다린 후 얼음-소금 욕조에 10분간 넣어 완전히 침전되도록 합니다. 4°C, 10,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 원심분리관에 담아 보관하고 뚜껑을 덮거나 필름으로 밀봉한 후 냉장고에 넣어 냉동보관한다. ("분할 II"라고 함) . 상등액을 버리기 전에 소변 포도당 테스트 스트립으로 효소 활성을 확인하십시오(다음 실험에서 이 작업을 함께 수행하십시오).
3. DEAE 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피를 이용한 효소 단백질 정제
(1) 이온 교환체 처리
DEAE 셀룰로오스(DE-32) 1.5g을 칭량합니다. 분말을 건조하고 0.5mol/L NaOH 용액(약 50m1)을 첨가하고 가볍게 저어주고 최소 0.5시간(1시간 이하) 동안 담가둔 다음 유리 모래 깔대기로 여과하고 거의 중성이 될 때까지 탈이온수로 세척합니다. 건조 후 작은 비이커에 넣고 0.5mol/L HCl 50mL를 첨가하고 잘 저어준 후 0.5시간 동안 담가둔 후 탈이온수로 세척합니다. 거의 중성에 가까운 경우 0.5 mol/L NaOH로 1회 처리를 반복하고, 거의 중성이 될 때까지 탈이온수로 세척한 후 물기를 빼서 나중에 사용합니다(DEAE 셀룰로오스는 가격이 비싸기 때문에 사용 후 재활용해야 합니다). 실제 작업에서는 일반적으로 셀룰로오스를 침지하여 회수하는데, 산 세척 후 중성이 될 때까지 물로 세척하는 것이 쉽기 때문에 "알칼리산"의 순서로 세척할 수 있다. 알칼리 세척 시 여과가 어렵기 때문에 먼저 부유하여 미세한 입자를 제거한 후 물기를 제거하고 0.5 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl 용액으로 처리한 후 중성이 될 때까지 물로 세척할 수 있습니다.
(2) 컬럼 패킹 및 평형
먼저 크로마토그래피 컬럼을 수직으로 설치하고, 비커에 담긴 0.02 mol/L, pH7.3 Tris-HCl 완충액으로 셀룰로오스를 여러 번 세척합니다. , 점적기를 사용하여 비커 바닥에 있는 큰 셀룰로오스 입자를 흡수하여 컬럼에 넣은 다음, 로딩 전 유출액의 pH가 완충액의 pH와 동일하거나 가까워질 때까지 이 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 샘플.
(3) 시료 로딩 및 용출
시료를 로딩하기 전에 그라디언트 믹서를 준비하세요. 자세한 내용은 부록 TH-500 그라디언트 믹서 사용 지침을 참조하세요.
알코올 분획 II를 완전히 용해하려면 0.02mol/L, pH7.3 Tris-HCl 완충액 5mL를 사용하십시오. (유리 교반 막대 헤드는 둥글게 되어 있어야 하며 교반할 때 원심분리 튜브가 긁히지 않도록 주의하십시오. 용액이 탁한 경우 4000r/min로 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 상등액(즉, 효소 활성 및 단백질 함량을 측정하기 위한 다음 실험을 위해 남겨두는 알코올 분획 II 시료) 1.5mL를 취하고, 컬럼 베드를 건드리지 않고 남은 상층액 3.5mL를 크로마토그래피 컬럼에 조심스럽게 첨가합니다. 그런 다음 약 30mL의 완충액을 사용하여 A280이 0.1 이하로 떨어질 때까지 컬럼에 있는 흡착되지 않은 단백질을 씻어냅니다. 시료 로딩 초기부터 2.5~3.0mL/l0로 수집하려면 부분 수집기를 사용하십시오. 튜브당 분. 그런 다음 그라데이션 혼합기를 열고 30mL, 0.02mol/L, pH 7.3 Tris-HCl 완충액과 0.2mol/L NaCl이 포함된 30mL 0.02mol/L, pH 7.3 Tris-HCl 완충액을 사용합니다. 선형 그라데이션 용출, 용출액의 연속 수집. , 제어 유량 2.5 ~ 3.0mL/10min. 각 용출액 튜브의 A280 광 흡수 값을 결정합니다.
(4) 각 튜브에서 나오는 용출액의 효소 활성에 대한 정성 측정
드립 플레이트의 각 웰에 0.2 mol/L, pH 4.6 아세테이트 완충액 한 방울을 추가합니다. 0.5mol/L 자당 한 방울과 용리액 한 방울을 넣고 5분간 반응시킨 후 작은 띠의 소변 포도당 시험지를 동시에 각 웰에 넣고 10~20분 후 시험지의 색 변화를 관찰합니다. . " " 표시의 숫자는 색상의 깊이, 즉 각 튜브의 효소 활성을 나타냅니다. 활성도가 가장 높은 튜브 2~3개를 합하여 총량을 측정하여 10개로 나누어 각각 10개의 작은 시험관에 붓고 비닐랩으로 밀봉한 후 냉동하여 사용하세요. "열 분수 III"입니다.
4. 각 분획 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 Sucrase 활성
0.02 mol/L, pH 4.6 아세트산 완충액 사용(pH 5~6의 탈이온수 사용 가능) 대신) 효소 용액의 각 분획을 희석하고 효소 활성에 대한 적절한 희석 인자를 측정합니다.
Ⅰ: 1,000 ~ 10,000배
II: 1,000 ~ 10
Ⅲ: 100~1,000배;
위 희석비율은 참고용입니다.
각 시약을 '표 1'의 순서대로 시험관에 넣고 측정을 진행하면 작업을 단순화하기 위해 비닐랩 밀봉을 해제하고 끓는 물 중탕 가열을 대체할 수 있다. 90~95°C 수조에서 8~10분간 5분 동안 생성된 환원당의 mg수를 세로축으로 하고, 시험관 내 반응혼합물 1mL의 효소농도(mg단백질/m1)를 값으로 한다. 가로축에 반응속도와 효소농도의 관계곡선을 그리시오.
표 1 각 분획 I, Ⅱ, Ⅲ의 인버타아제 활성 측정
각 튜브 이름 대조 분획 Ⅰ 분획 Ⅱ 분획 Ⅲ 포도당
튜브 번호 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
효소액/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
아세트산 완충액 0.2mol/L, pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
포도당 2mmol/ L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
자당 0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
자당을 넣고 흔들어주세요 즉시 잘 반응하고 타이밍을 시작합니다. 실온에서 5분간 정확하게 반응한 후 즉시 0.1M NaOH 1mL를 첨가하여 반응을 중지합니다.
디니트로살리실산 용액 1.0mL
플라스틱 랩으로 밀봉합니다. 눈에 띄는 경우에는 끓는 수욕탕에 5분간 가열한 후, 즉시 물로 3분간 식혀주세요.
H2O/mL 4.0
A520
희석된 효소 활성/
원래 효소 활성/
5 . 쿠마시 브릴리언트 블루 방법을 사용하여 각 분획의 단백질 함량을 결정합니다.
(1) 단백질 표준 곡선 작성
14개의 시험관을 두 그룹으로 나누고 다음과 같이 병렬로 작동합니다. 테이블로.
표 2 단백질 표준곡선 작성
시험관 수/mL 0 1 2 3 4 5 6
표준 단백질 용액/mL
A595nm
(2) 각 분획의 단백질 함량 측정
Coomassie Brilliant Blue G-250은 산성 용액에서 차를 갈색으로 변합니다. 465nm에서 흡수 피크. 단백질과 결합하면 진한 파란색으로 변하고 최대 흡수 피크는 595nm로 이동하며 이는 단백질 농도 범위 10~100μg/mL에 비례합니다. 따라서 각 분획물의 단백질 함량을 측정할 때에는 측정값이 표준곡선의 직선 범위에 들어가도록 적절한 희석을 하여야 한다. 측정된 A595nm 값에 따라 표준곡선에서 표준단백질과 동등한 양을 찾아 미지 시료의 단백질 농도(mg/mL)를 계산합니다.
6. 각 분획의 비활성, 정제 배수 및 회수율을 계산합니다.
아래 표 3의 데이터를 측정하고 계산하려면 매번 각 분획을 샘플링해야 합니다. 샘플을 채취하면 부피의 일부가 다음 분획으로 손실되므로 회수율 계산에 부정적인 영향을 미치지 않도록 다음 분획의 부피를 수정해야 합니다.
1 활성 단위(U) = 실온 및 pH=4.6에서 분당 1μmol의 포도당을 가수분해하는 데 필요한 효소의 양입니다. 특정 활성 = 활성 단위/mg 단백질.
표 3 각 분획의 비활성, 정제 배수 및 회수율
등급
분획 기록
용량
(m1) 보정
용량
(m1) 단백질
(mg/m1) 총 단백질
(mg) 단위
(s/m1) 총 활동량
(U) 특정 활동량
(단위
/mg) 정화
다중 복구율
(%)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
표 아래 4는 분획별 가정 기록량에 대한 보정 계산 방법 및 결과이다.
표 4 실험 기록표
분수 기록량(m1) 교정량 계산 샘플링량
(m1) 보정량
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／ 13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
V. 결과
같은 그림에 효소 활성을 그려라. , 흡광도 값 A280 곡선 및 모든 튜브의 용출 구배 선. 각 분획의 활성, 비활성, 정제 배수 및 회수율을 구했습니다.
6. 주의사항
샘플 로딩 시작부터 두 개의 활성 피크가 있을 수 있습니다. 기울기 용출 시작 전 첫 번째 피크는 본 실험에 사용된 비흡착 물질입니다. . 구배 용출이 시작된 후 활성 피크가 씻겨 나갔습니다.
7. 숙제
1. 효소 추출에 저온 조작이 필요한 이유는 무엇입니까?
2. 열처리의 기본은 무엇입니까?
열에 민감한 단백질을 제거하세요.
참고자료
1. 샤오쉐링, 마오신, 궈이칭. 생화학 및 분자 생물학 실험 지침. 우한: 우한 대학 출판부, 2003
2. 장롱샹. 선택된 고급 생화학 실험. 베이징: 고등교육 출판부, 1989
3. Xu Peiya, Qiu Lequan. 이온교환 컬럼 크로마토그래피를 이용한 수크라제 정제 실험방법 개선에 관한 연구. 실험실 연구 및 탐사, 2002, 21(3):82~84
편집자-Chen Yan, Li Shaofei