주의 사항
(1) 효모 2-하이브리드 컨트롤 설정 기존 효모 2-하이브리드 작업에서는 일반적으로 양성 대조, 음성 대조 및 발색 시스템의 세 가지 유형의 대조가 설정됩니다. MATCHMAKER GAL4 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템을 예로 들면:
양성 대조군: pGADT7-T pGBKT7-53, 여기서 T 단백질과 53 단백질이 결합할 수 있는 것으로 확인되었습니다. 두 단백질의 효모 세포에서 리포터 유전자 발현을 시작합니다.
음성 대조군: pGADT7-T pGBKT7-lam, 여기서 T 단백질과 lam 단백질은 효모 세포에서 결합할 수 없다는 것이 분명합니다. 시스템 색상 조절인 pGADT7-Pcl1, 이 발현 플라스미드는 효모 세포로 전달되어 β-갈락토시다제 및 β-갈락토시다제의 분비를 유발함으로써 발색 시스템에 문제가 있는지 여부를 검출할 수 있습니다.
(2) 위양성 현상 위양성 결과를 유발할 수 있는 많은 이유가 있으며, 다음 세 가지 일반적인 이유는 다음과 같습니다.
스크리닝된 라이브러리 단백질 자체에는 전사 활성이 있으며 다음을 활성화할 수 있습니다. 리포터 유전자 발현 - 이 상황에서는 스크리닝된 후보 단백질의 자가 활성화 검증이 필요합니다.
효모 세포에는 동시에 하나 이상의 라이브러리 단백질이 포함될 수 있으며, 라이브러리 단백질 중 하나가 미끼 단백질과 서로 결합할 수 있습니다.
이 경우, 각 효모 클론에 한 종류의 라이브러리 단백질과 미끼 단백질만 포함되도록 양성 클론을 2~3회 다시 플레이팅해야 하며, 플레이팅 횟수가 너무 많아서는 안 됩니다. 너무 많으면 단백질 발현 플라스미드가 손실될 수 있습니다. 알 수 없는 이유로 인한 기타 위양성 - 이 경우 스크리닝된 후보 라이브러리 플라스미드와 미끼 단백질을 발현하는 플라스미드는 효모 세포에 다시 형질감염되거나 필요한 경우 pGADT7-의 벡터를 효모 세포로 재검증해야 합니다. cDNA 플라스미드와 pGBKT7-bait 플라스미드를 교환하여 pGADT7-bait 및 pGBKT7-cDNA를 구성하고 효모 세포에서 재검증했습니다. 진정한 양성 조합은 교환 후 효모 세포에서도 양성 결과를 생성할 수 있습니다.
(3) 일반적인 문제 및 참조 프로토콜: 형질전환 효율이 너무 낮습니다. 효모의 생존 가능성을 보장하기 위해 직경이 약 2~3mm인 신선한 배양 배지와 신선한 효모 클론을 사용해 보십시오. 형질전환에 사용되는 플라스미드는 플라스미드의 순도와 농도를 향상시키기 위해 사용하기 전에 에탄올을 침전시킬 수 있습니다.
혼성화 효율이 낮습니다. 이는 발현된 융합 단백질이 효모 세포에 독성을 나타내기 때문일 수 있습니다. 어떤 경우에는 액체 배양 배지에서 잘 자라지 않는 효모가 아가로스 고체 배양으로 대체됩니다. 이 경우에는 *** 형질전환 방법을 사용하여 단일 형질전환된 효모 클론을 5개의 10mm 배양 플레이트에 펼쳐 놓을 수 있습니다. 5mL 0.5×YPDA. 재현탁 후 일반적인 혼성화 절차를 따르십시오. 배경이 너무 높음 - HIS3를 리포터 유전자로 사용하는 경우 HIS3 유전자의 어느 정도 누출 발현으로 인해 배경이 너무 높을 수 있습니다. 이 경우 HIS3 단백질 경쟁 억제제 3-AT(3)를 적당량 투여해야 합니다. -아미노)를 사용하여 배경을 줄이거나 Ade와 같은 보다 엄격한 리포터 유전자 스크리닝을 추가할 수 있습니다.
미끼 단백질에는 자가활성화 현상이 있는데, 자가활성화 아미노산 서열을 녹아웃(knock out)하거나 변이시키는 방법으로 클로닝(cloning) 및 돌연변이(mutation) 방법을 사용할 수 있으나 이 방법은 두 단백질 사이의 상호작용을 파괴할 수 있다.