제한 효소 매개 통합 (restriction enzyme mediated integration, REMI) 기술은 Schiestl 과 Petes 가 1991 년 Saccharomyces cerevisiae 를 연구할 때 처음 건립했으며 현재는 실크 곰팡이의 유전적 변환에 널리 사용되고 있다 연구에 따르면 변환 혼합물에 제한 효소를 넣으면 변환 효율성이 크게 향상되는 것으로 밝혀졌으므로 제한 효소는 곰팡이 삽입 돌연변이의 효율성과 단일 복사 삽입의 효율성을 높이는 데 사용되었습니다 (K Ahmann R ET al., 1999; Riggle PJ et al, 1998) 을 참조하십시오. 단일 복사 플라스미드의 비 상 동성 통합을 통해 유전자 돌연변이를 만들어 유전자 마커를 직접 얻을 수 있으며 플라스미드 구조 및 기타 기술을 통한 유전자 복제 및 기능 분석을 통해 변환 효율을 크게 향상시킬 수 있습니다.
8.1.6.1 제한 효소 매개 통합 (REMI) 의 기본 원리
제한 내체효소는 생물체에서 특수한 쌍체인 DNA 서열을 식별하고 절단할 수 있는 내체핵산효소로, DNA 의 특이한 부위를 인식하고 그 부위에서 절단할 수 있다. 효소로 자른 선형 플라스미드와 제한 내체 효소로 구성된 전환 혼합물이 세포를 전환시킬 때, 제한 내체 효소가 수용체 세포에 들어간 후 세포 게놈을 절단하여 선형 플라스미드와 보완되는 끈끈한 끝을 만들어 내고, 이후 외원 플라스미드는 염기쌍을 통해 게놈을 삽입한다. 삽입이 알려진 유전자 내부에서 발생하는 경우, 그 유전자의 기능이 변경되거나 상실될 수 있습니다. 즉, 유전자 돌연변이가 발생할 수 있습니다. 알 수 없는 유전자 내부에서 삽입이 발생하면 수용체 세포 표현형의 변화를 통해 변형자를 선별한 다음 플라스미드 구조 (plasmid rescue) 와 결합하여 새로운 유전자를 발견하면서 그 유전자를 심도 있게 연구할 수 있다. 외원 플라스미드가 항성 유전자를 가지고 있을 때, 이 항성 유전자의 수용체 세포 내 표현을 이용하여 변형자를 선별할 수 있는데, 이 과정은 바로 유전자 표지이다.
8.1.6.2 제한 효소 매개 통합 Trichoderma 변환 일반 단계
REMI 는 제한적인 내체효소 매개하에 선형 플라스미드 DNA 를 수용체 세포 게놈에 무작위로 삽입하는 기술로 유전자 돌연변이, 유전자 표시, 새로운 유전자 찾기 등에 대한 연구에 쓰인다. REMI 전환은 일반적으로 세 가지 과정인 곰팡이 원형질체 준비 (과정 8.1.1 참조), 효소 매개 전환 제한 및 전환자 선별로 구성됩니다.
제한 효소 매개 전환, 제한 내체효소의 존재 하에서 제한 효소에 의해 절단된 선형화 입자가 PEG 매개 또는 전기 충격을 통해 세포를 전환시킨 후, 세포에 들어가는 제한 내체효소는 수용체 세포 게놈의 특정 부위를 절단하여 선형 입자와 보완되는 끈끈한 끝을 만들어 내고, 외원 입자와 염기쌍을 통해 연결되므로 입자와 게놈이 통합됩니다. 플라스미드의 선형화는 일반적으로 6 개의 염기서열을 식별하는 제한적인 내체효소를 사용하는 반면, PEG 매개 또는 감전 시 * * * 변환용 제한 내체효소는 플라스미드 선형화에 사용되는 것과 동일한 제한 내체효소나 4 개의 염기서열을 식별하는 동미효소를 사용할 수 있다. 4 개의 염기서열을 식별하는 제한 내체효소는 6 개의 염기서열을 식별하는 동미효소보다 게놈 DNA 를 자르는 빈도가 더 높다. (그들이 인식할 수 있는 서열은 완전히 무작위적인 경우 평균 256 개와 4096 개의 염기마다 하나의 식별점이 나타난다.) 따라서 선형 플라스미드가 무작위로 게놈에 통합되는 부위가 더 다양하고 유전자가 돌연변이를 얻을 확률이 높다. REMI 입자에는 성공적으로 통합된 전환자를 쉽게 선별할 수 있는 필터링 표시가 포함되어 있습니다. 스크리닝 마커는 사용 된 플라스미드에 의존하며, 우라실 영양 결핍 세포의 사용과 같은 영양 결함 마커를 사용할 수 있으며, 플라스미드가 통합 된 후 세포가 우라실 합성 능력을 회복시킨다. 내성성 유전자를 가지고 있는 플라스미드 (예: 조마이신과 볼레마이신 (Zeocin) 유전자 등) 도 사용할 수 있는데, 이에 대한 구체적인 제한은 없다.
형질 전환 하위 스크리닝, 플라스미드 삽입 게놈은 무작위이며, 삽입 결과는 특정 유전자 또는 특정 유전자의 기능을 상실하고 결국 세포의 특정 표현형이 손실되거나 새로운 표현형을 얻는 것으로 나타날 수 있습니다. 따라서 변환자 필터링 방법은 연구하고자 하는 세포 표형의 변화에 따라, 즉 다른 표형에 적합한 필터링 방법을 선택해야 한다. 예를 들어, 이기순 등 (2013) 은 외원 β-1,4-글루칸효소 유전자 REMI 법을 이용하여 녹색 곰팡이, 즉 조류마이신 (HygB) 내성 선별과 글루칸효소 활성 선별을 결합해 고효율 생방제 곰팡이 공학 균주 L-10 을 얻는다. Tang 등 (2009) 은 제한 내체효소 매개 통합 (REMI) 을 이용해 유기인 농약 (적외경) 분해 기능을 갖춘 짙은 녹색나무 곰팡이 (T.atroviride)T23 을 구축해 적외적 분해능력에 대한 야생주보다 T23 을 크게 개선한 전환자를 얻었다.
8.1.6.3 효소 매개 통합 변환의 영향 요인 제한
REMI 변환에서는 제한적인 내체효소를 2 회 사용했고, 한 번은 플라스미드의 선형화에는 제한적인 내체효소 처리가 필요했다. 또 한 번은 제한적인 내체효소와 선형화된 플라스미드 * * * 로 수용체 세포를 변환해 수용체 세포에 들어간 후 제한적 내체효소로 수용체 세포 게놈을 절단한다. 그 중에서도 플라스미드 효소는 유전자 공학의 통상적인 기술로, 레미의 실험 결과에 큰 영향을 미치지 않지만, 큰 영향은 * * * 변환 과정에 관련된 제한적인 내체효소이다.
제한 내체효소가 전환율에 미치는 영향은 다음과 같다. 1 제한 내체효소의 첨가는 전환율을 높이지만 미생물에 따라 제한 내체효소가 전환율에 미치는 영향이 다르다. 예를 들어, 절단 활성이 있는 제한적인 내체효소 작용에서 선형 입자가 디스크 기반 메쉬 생크 게놈에 삽입되는 빈도는 효모 (Kuspa A et al, 1994) 보다 큽니다. ② 일정 범위 내에서 제한적인 내체효소의 양이 증가하면 전환률을 높일 수 있지만, 최고점에 이르면 제한 내체효소의 양이 계속 증가하면서 감소한다 (VanDijk R et al, 2001). ③ 제한 내체 효소의 절단 활성은 전환율에 중요한 요인이다. 예를 들어 Palaniyandi(1998) 실험용 Bamh I 는 돌연변이인 Bamh I-E77K 단백질로 대체된다. 이는 Bamh I 부위와도 결합될 수 있지만 DNA 절단 속도는 Bamh I 의 1/1000 에 불과하며 Bamh 가 한다. 이 결과는 제한적인 내체 효소의 절단 활성이 그것이 매개하는 REMI 에 필요하다는 것을 보여준다.
일반적으로 REMI 는 플라스미드에 대한 특별한 요구 사항이 없으며, 일반적으로 플라스미드 효소와 * * * 전환에 의해 선택된 제한 내체효소는 동일한 점성 끝을 가져야 하지만, 플라스미드가 수용체 세포 게놈에 삽입되기 위한 전제가 반드시 플라스미드와 게놈이 제한 내체효소에 의해 절단된 후 발생하는 끝이 완전히 보완되는 것은 아니며, 플라스미드의 끝이 점단일 필요는 없지만, 선형화가 필요한 플라스미드의 끝과 수용체 세포 게놈이 생산하는 끝은 적어도 2 개 한 가지 설명은 수용체 세포에 DNA 를 적절히 손질할 수 있는 효소 시스템이 있다는 것이다. 이 효소 시스템은 짝이 맞지 않는 염기를 제거하고, DNA 연결 효소에 의해 촉매 된 염기를 추가하고, 외체 효소를 추가하여 평평한 끝을 끈끈한 끝으로 바꾸는 등 플라스미드와 수용체 세포 게놈의 끝을 다시 쌍으로 만드는 것이다. 그러나 다른 종의 유사한 효소 시스템의 보편성은 여전히 더 연구해야 한다.