(1. 중국 농업과학원 란저우 수의연구소 가축병 병원생물학 국가 중점 연구실, 간쑤 란저우 7346; 2. 티베트 자치구 농목과학원 축목수의연구소, 티베트 라사 85)
요약: 역유전기술은 새로운 분자생물학 기술로, 음사슬 RNA 바이러스 게놈 구조와 기능을 깊이 연구하고 게놈 복제, 전사, 신종 유전공학 백신 개발에 중요한 역할을 한다. 문장 (WHO) 는 분절과 불분절 음의 체인 RNA 바이러스의 복제 메커니즘과 특징을 소개하고, 역유전학이 이러한 바이러스에 대한 전략, 최신 연구 진전 및 주요 구조 효율성에 영향을 미치는 요인을 논술했다. 음의 체인 RNA 바이러스 벡터와 그 재구성 바이러스의 연구 동태를 더 다루고 있습니다. 따라서 역유전학을 통해 사람들은 네거티브 체인 RNA 바이러스를 더 잘 이해하고 과학적 활용과 효과적인 통제를 위한 토대를 마련할 것이다. (윌리엄 셰익스피어, 윈스턴, 유전학, 유전학, 유전학, 유전학, 유전학, 유전학, 유전학, 유전학)
키워드: 역 유전학; 음의 사슬 RNA 바이러스; 바이러스 벡터 < P > 역유전 (Reverse genetic) 기술은 복제된 cDNA 에서 감염성 RNA 바이러스를 생산하는 과정으로 cDNA 수준에서 RNA 바이러스를 작동시켜 바이러스의 기능 게놈 연구에 강력한 수단을 제공한다. 상대적으로 이 기술은 정체인 (Positive-strand)RNA 바이러스에 더 쉽게 사용되어 cDNA 수준에서 게놈을 조작하여 감염성 바이러스를 구할 수 있다. 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 한탄 바이러스, 라사 바이러스, 크리목-콩고 출혈열 바이러스 등 네거티브 체인 (Negative-strand, NS)RNA 바이러스는 독특한 생물학적 특성으로 인해 바이러스 구제에 어려움을 겪고 있습니다. 현재 이 바이러스 연구에 역유전 기술을 적용해 이들 바이러스 게놈의 구조와 기능, 표현 조절 메커니즘, 발병 메커니즘 등에 큰 영향을 미치고 있다.
1 마이너스 체인 RNA 바이러스의 복제 메커니즘 < P > 마이너스 체인 RNA 바이러스에는 7 개의 바이러스과 [1] 즉 탄상바이러스과, 부점바이러스과, 실크 바이러스과, 보르나 바이러스과, 정점바이러스과, 부니 바이러스과, 모래입자바이러스과가 있다. 이 중 상위 4 과 바이러스는 세그먼트화되지 않은 단일 음의 체인 RNA 바이러스이고, 하위 3 과 바이러스는 세그먼트화된 음의 체인 RNA 바이러스로 각각 6 ~ 8 개, 3 개, 2 개의 음의 체인 RNA 조각을 포함하고 있다.
SNS (segmented negative-strand) 또는 NNS (non-segmented negative-strand) 네거티브 체인 RNA 바이러스 정점코 바이러스와 보르나코 바이러스는 제외하고 핵에서 전사와 복제가 이루어지며, 일부 mRNAs 도 오려내야 한다. 전통적인 mRNA 정의사슬의 경우, 네거티브체인 RNA 바이러스 게놈과' 보보보성' 게놈의 RNAs 는 핵단백질 (N 또는 NP) 껍데기로 둘러싸여 있고, * * * 같은 전사로 나선형 대칭 N-RNA 템플릿을 형성하며, 다양한 양의 폴리효소 단백질 (부점바이러스, 탄상바이러스, 보르나) 을 형성한다. 인플루엔자 바이러스의 PA, PB1, PB2 를 결합하여 가장 작은 복제 시작 복합체 (RNP (리보 핵단백질 복합체) 를 형성하는데, 일단 기능성 RNP 복합체가 형성되면 전사, 복제, 바이러스 증식도 시작됩니다. < P > 네거티브체인 RNA 바이러스는 바이러스 입자 표면의 글리코겐을 통해 숙주 세포의 수용체와 결합한 후 바이러스의 낭막과 포장막 (pH 비의존성 경로) 또는 내체막 (pH 의존성 경로) 의 융합이 발생한 다음 바이러스의 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 세포질로 방출한다. RNP 복합체는 바이러스 RNA, RNP 전사 과정에서 먼저 바이러스에 의해 운반되는 RNA-RNA 중합 효소가 바이러스 게놈 (-RNA) 에서 mRNA 를 옮긴 다음 필요한 효소와 구조 단백질을 번역합니다. 복제 과정에서 바이러스 게놈 길이와 일치하는+RNA 를 전사하여 템플릿 합성 바이러스의 RNA 로 사용할 수 있습니다. 대부분의 네거티브 체인 RNA 바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제되고, 보나바이러스와 포지티브 바이러스는 세포핵에서 복제되기 때문에 후자의 경우 RNP 복합체와 새로 합성된 NP 와 폴리효소 단백질은 핵으로 운반되어야 하고, 새로 합성된 RNP 복합체는 세포핵에서 세포질로 운반되어 새로 합성된 RNP 복합체가 세포질막이나 골기 복합막에서 바이러스의 구조단백질과 함께 조립된다.
SNS-RNA 바이러스와 NNS-RNA 바이러스의 뚜렷한 차이점은 복제 및 mRNA 전사 메커니즘에서 SNS 바이러스의 각 섹션은 별도의 전사, 복제 단위를 나타내며 각 섹션의 3' 끝, 5' 끝에 있는 뉴클레오티드는 보수적이며 부분 역상보성을 보여 염기를 유발한다는 것입니다. NNS 바이러스의 경우, 그들의 전사는 vRNA 템플릿에서만 시작되며, 이 규칙을 이행하지 않는 것은 모래알 바이러스와 일부 부니 바이러스과 바이러스 [2] 이다.
2 네거티브 체인 RNA 바이러스에 대한 역방향 유전 기술의 연구 전략 < P > cDNA 에서 왔든 합성 RNA 에서 왔든, 네거티브 체인 RNA 바이러스의 구원은 정체인 RNA 바이러스와 다르다. 구체적으로 (1) 네거티브 체인 바이러스 복제부터 단백질을 처음부터 새로 합성해야 하는데, 이 과정은 자신이 RNA 에 의존하는 RNA 에 달려 있다. (2) 게놈과' 보보보성' 게놈 RNA 로 들여오기 전에 기능 모델 체인으로 전사/복제를 자극하기 전에 바이러스 핵단백질 껍데기에 싸야 한다. 그럼에도 불구하고, 일부 전략은 광견병 바이러스, 우역병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 등과 같은 음의 사슬 RNA 바이러스의 감염성 분자 복제를 받았으며, 다른 연구 목적에 따라 DNA 수준에서 체외 조작을 수행했습니다. 방법은 유전자 녹아웃, 유전자 누락, 유전자 삽입, 유전자 교체, 키메라 바이러스 구축 등이다. < P > cDNA 복제에서 감염성 네거티브 체인 RNA 바이러스를 얻으려면 새로운 RNA 캡틴을 만들고 다운스트림 시퀀스를 처리할 수 있는 마이크로복제 시스템을 구축해야 합니다. 이 시스템에서는 T7 RNA 중합 효소를 자주 이용하여 바이러스 게놈의 cDNA 를 템플릿으로 사용하여 네거티브 체인 RNA 바이러스의 RNA 를 합성한 다음, 이 인공바이러스 RNA 를 이미 보조바이러스에 감염된 진핵세포로 전염시키면 인공RNA 를 함유한 바이러스를 얻을 수 있다. 현재 이 시스템을 사용하여 센다이 바이러스 (SEV) 와 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV) 와 같은 작은 게놈의 보고 유전자를 구하는 데 성공했다. < P > 전장 감염성 cDNA 를 구하는 것은 복잡하고 기술함량이 높기 때문에 감염성 바이러스 매개 cDNA 를 얻기 전에 NNS 와 SNS 바이러스의 기능성 작은 게놈 [3] 을 구축해야 하며, 작은 게놈은 길이가 작고 조작하기 쉽다. 구원에서 어떤 요소들은 구원의 효과와 성패를 결정한다. 네거티브 체인 RNA 바이러스의 비코딩 끝 근처에는 일반적으로 단일 보고 유전자 공개 읽기 상자가 포함되어 있으며, 감염성 재구성 바이러스를 구축하는 데 매우 유용한 대체 시퀀스로, 바이러스의 성패에 영향을 줍니다. 야생형 T7 프로모터는 구원의 효율을 제어하며, T7 시동 서열을 제거하면 대부분의 바이러스의 구조 효율이 높아진다. 예를 들어, 정형간염 바이러스 핵효소 5' 자가 절단이 정확한 3' 바이러스 끝을 만들어 낼 때 구조 효율이 높아진다. 더 깊은 견해에 따르면, 대부분의 부점바이러스 게놈이나 게놈 유사체는 기능을 해야 하며, 6 법칙에 복종해야 하며, 대부분의 부점바이러스의 효과적인 복제는 뉴클레오티드의 총수를 6 으로 나눌 수 있을 때만 관찰할 수 있다. 우리는 이를' 6 법칙' [4] 이라고 부른다. 즉, 핵산단백질은 정확한 6 뉴클레오티드와 상호 작용한다. T7 을 표현하기 위해 일부 과학자들은 CMV 보강자/시동자 또는 닭-ACTIN 시동자가 제어하는 표현 전달체와 T7 중합효소를 안정적으로 표현하는 세포주를 대체물로 사용하지만 결과는 좋지 않다. 최근 RNA 중합 효소 I (POL II) 를 사용하여 T7 시동 시스템의 대부분의 단점을 극복했다. Yanai H 등 [5] 역유전시스템에서 RNAPolⅡ II 프로모터를 사용하여 Borna 바이러스의 작은 게놈 표현의 효과를 연구한 결과 SV4 T 항원이 부족한 세포에서 SV4 핵산 시퀀스가 POL II 에 삽입되어 작은 게놈의 복제를 효과적으로 개선할 수 있는 것으로 나타났다.
NNS 와 SNS 바이러스의 구원은 여전히' 보보보성' 게놈 구축체를 바탕으로 1994 년 처음으로 NS RNA 바이러스 (막대 바이러스, 광견 바이러스) 를 성공적으로 구했는데, 이 방법의 성공의 관건은 cDNA 복제에서 정체인' 보보' 게놈 RNA 를 합성할 수 있다는 점이다. 21 년 단백질 표현과 vRNA 의 전사를 위해 T7 과 PolⅠ I 구동체계를 사용하여 6 단 Thogoto 바이러스 [6] 를 구했다. Flick R 등 [7] 작은 게놈 구조 시스템 (CCHF, Uukuniemi, Hanaan, Borna 바이러스 등 일부 부니 바이러스) 을 기반으로 PolⅠ I 시스템이 널리 사용되고 있으며, 이 시스템은 RNA 바이러스를 구하는 데 효과가 있는지 여부를 더 확인할 필요가 있다.
3 역유전시스템의 응용
3.1 NS RNA 바이러스 < P > 역유전학 연구는 RNA 바이러스의 분자생물학과 발병 메커니즘에 대한 인식을 넓혔다. 바이러스의 수명 주기를 통제하는 데 있어서 작은 게놈의 연구는 특히 중요하다. 주로 순식 반응 요소의 위치, 시동 영역의 2 차 구조, 반작용 계수의 리본, 게놈, 보완 게놈 시동기의 상대적 강도 등이 있다. 역유전 분석은 RNA 바이러스 순식 작용 요소의 결정과 식별에 성공적으로 적용되었다. NNS 와 SNS 바이러스의 작은 게놈에 대한 연구에 따르면 전사, 복제, 껍데기화, 포장의 순식 작용 요소는 3' 끝과 5' 단 비코딩 뉴클레오티드 서열에 있다. 인플루엔자 바이러스는 각 세그먼트의 끝에서 12 ~ 13 개의 뉴클레오티드 상호 작용이 바이러스 증식에 영향을 미치는 기본 코어 프로모터로 구성되며, 인접한 비코딩 뉴클레오티드는 복제 효율이 가장 좋습니다. Li Z 등 [8] 역유전기술로 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 재조합체를 만들었는데, 하나는 DKGX/22 (치병성 없음) 에 삽입된 유전자이고, 다른 하나는 DKGX/35 (고병원성) 7 개의 유전자 조각을 삽입해 쥐를 접종한 결과 PB2 의 71 위 아미노산이 감염된 동물에 있는 것으로 확인됐다. < P > 시동자 구조에 대한 지식이 부족하기 때문에 RNA 선택/인식 메커니즘에 대한 상 동성 중합 효소의 연구는 특히 어렵습니다. 프로모터 컴포넌트의 기본 뉴클레오티드 교체가 RNA 의 필수 구조를 파괴할지, 아니면 템플릿과 중합 효소 사이의 우선 뉴클레오티드 특수 반응에 영향을 미칠지는 아직 분명하지 않다. 이러한 부족에도 불구하고 A 형 인플루엔자 바이러스 시동자에 대한 구체적인 분석을 통해 체인 내 구조와 바이러스 복제를 시작하는 데 필요한 템플릿과 중합 효소 반응 메커니즘에 대해 기본적으로 알고 있습니다. 뉴클레오티드 대체 메커니즘에 따르면, Flick 과 그의 동료들은 독특한 바이러스 RNA 시동 영역' corkscrew' 를 묘사했습니다. 이 구상에는 먼 곳의 6 염기쌍 막대 구조와 2 개의 체인 내 염기쌍 줄기-고리 구조가 포함되어 있습니다. 단일 교체와 이중 보완 돌연변이 유발은 구조가 변하지 않는 핵이 희소하다는 것을 보여주는데, 이 지역 구조의 무결성을 유지하는 것이 매우 중요하며, 이는 변하지 않는 핵이다. 중합효소 복합단백질과의 반응에 도움이 될 수 있으며, 최근 및 이전 연구에서도' corkscrew' 구조 [9] 가 이 바이러스가 이전에 예상했던 시동 모델보다 더 복잡하고 냄비 손잡이와 포크 구조가 있는 것으로 확인됐다.
3.2 재조합 바이러스 벡터 < P > 네거티브 체인 RNA 바이러스의 특수한 생물학적 특성으로 인해 DNA 매개 복제를 통해 복제될 수 없으므로 RNA 바이러스의 게놈이 숙주 게놈에 통합되지 않습니다. ② 이런 바이러스의 대다수 구성원은 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있다. ③ 외인성 유전자를 수용하고 높은 수준으로 단백질 또는 펩타이드 세그먼트를 표현할 수있다. ④ 부정적인 사슬 RNA 바이러스는 숙주 자극으로 비교적 강한 세포 면역과 체액 면역을 생산할 수 있다. < P > 바이러스를 재구성하면 외원 유전자 물질을 안정적으로 표현할 수 있어 새로운 치료 관념과 전염병 예방 샘플 [1] 을 확립했다. 부점바이러스와 탄상바이러스는 외원 유전물질의 안정적인 삽입에 특히 적합하다. 이 바이러스들은 5 kb 크기의 외원 유전 물질을 수용하고 표현할 수 있어 2 가 모종, 심지어 다가 묘목을 만들 수 있다. 또한 다른 유전자 종료 및 시작 신호 도입을 통해 다른 전사 단위를 쉽게 삽입할 수 있으며, 최종 삽입 지점의 정확한 선택은 삽입된 유전자의 표현 수준을 제어합니다. 재조합 바이러스는 홍역 백신 바이러스와 같이 약독 백신에 사용되는 장기 안전기록이 있고, SEV 와 VSV 백신 바이러스와 같은 다른 바이러스는 인간에 대한 치병성 없는 것으로 고려된다. 이러한 바이러스의 수명 주기는 세포질에만 국한되어 있기 때문에 휴대할 위험이 없어 현재 전달체로 널리 사용되고 있다.
3.3 재조합 바이러스 백신 연구 < P > 재조합 바이러스 제조 약독 백신에서 일부 돌연변이 서열을 백신이나 야생형 독주에 삽입하면 백신 [11] 이 생겨나고, 다중 인식 효소 절단 부위를 단일 특수 효소 인식 부위로 유인해 독성을 약화시키고 백신 개발 목적을 달성할 수 있다. 일부 약독 재조합 바이러스 독력은 구조화되지 않은 인터페론 (Interferone) 유전자의 변화나 삭제와 관련이 있다. 이렇게 변한 바이러스는 숙주 인터페론의 영향을 줄이거나 막을 수 없기 때문에 독성이 약해지고 [12] 유전자의 재정렬도 독성을 약화시킬 수 있다. Veits J 등 [13] 역유전학을 적용해 H5 아형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 혈응고소를 표현할 수 있는 뉴캐슬병 바이러스를 구축하고, 융합유전자와 혈응고소- WebsterG 등 [14] 역유전학을 적용해 역동적인 H5N3 그루의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 구축한다. 이 바이러스 소화유유 백신 중 HA 단백질 함량이 .15NG ~ 1.2NG 에 이르면 오리가 H5N1 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 효과적으로 보호하는 역할을 할 수 있다.
3.4 바이러스 재구성의 다른 응용 프로그램 < P > 바이러스 재구성은 예방, 치료 및 연구와 같은 다른 분야에서도 사용되었습니다. 현재, 긍정적 인 열을 연구하고 있습니다.