1. 프라이머 농도
2. SYBR Green I 및 EvaGreen 을 사용하여 증폭 및 용해 곡선을 테스트하는 것이 좋습니다.
운영 절차:
I. 목표 선택 및 실험 설계
1. 대상 유전자 서열 증폭에 적합한 세그먼트를 선택합니다.
QRT-PCR 에 적합한 프라이머, 프로브 및 반응 조건이 있는지 확인하려면 다음 세 사이트를 확인하십시오.
적절하거나 검증된 참조가 없는 경우 다음 설계 시나리오는 정보 제공만을 목적으로 합니다.
A. 가장 널리 사용되는 상용 소프트웨어 C. Beacon Designer 가 원하는 결과를 얻지 못하거나 설계 대안의 수가 충분하지 않다면 선택할 수 있는 서비스 방안은 세심하고 주도면밀하다.
D. 무료 웹 아키텍처 기반 프라이머 및 프로브 설계 프로그램: 4-6 을 선택하여 프라이머를 실험하고 증폭 효율성과 감도가 높은 쌍을 선택할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 NCBI 웹 사이트와 직접 비교할 수 있으며 NCBI 의 ePCR 과 가상 전자 PCR 을 할 수 있습니다.
프라이머 디자인 소개
DNA 프라이머 길이: 15-25 개의 염기.
GC 함량: 약 50%
유인물 농축이 AT 구역에 결합되면 LNA 로 몇 개의 염기를 교체하고, 유인물 길이를 줄이고, 유인물 2 차 구조와 3'- 끝 이합체의 영향을 피하는 것을 고려해 볼 수 있다. 프라이머와 템플릿, 프로브와 과녁의 경쟁, 내부 교배, 역반복 등으로 인해 프라이머로 인한 프로브 쌍의 결합 효율성이 떨어지기 때문에 프라이머 이합체의 △G 를 음수로 선택했습니다.
프라이머 프로브의 보존은 일반적으로 다음 원칙을 따릅니다.
정방향 및 역방향 프라이머는-20 C, 농도는 10mM 또는 10× 작업 농도로 보관됩니다. 탐침은-70 C 에서 빛을 피하여 보관해야 하는데, 가장 좋은 것은 얼어붙은 가루의 형태이며, 액체의 작업 농도는 일반적으로 2 주 정도 유지된다.
2. 대상 일련순서를 입력하고 과 (와) 함께 합니다.
3. 비교 시퀀스의 다형성과 가능한 오류를 검사하여 프라이머와 프로브가 설계한 이러한 영역을 방지합니다.
4. 대상 시퀀스에서 직접 이 영역을 반복하지 않도록 합니다. 반복 영역의 교배는 유인물을 무효로 만들고 DNA 의 증폭 효율과 분석의 민감도를 낮추기 쉽다.
5. 잠재적인 스플라이싱 변이체와 적절한 과녁을 감안하면 인트론과 엑손의 경계는 화학분석을 통해 결정되며, 주로 cDNA 와 게놈 서열의 비교를 통해 결정된다. 일반적으로 가장 긴 내부 하위 영역을 가로질러 게놈 DNA 에 의한 증폭자 오염을 줄이도록 설계되었습니다. 이것은 매우 필요하다, 특히 DNA 가 표준화되고 특정 접합 돌연변이를 겨냥하는 데 사용될 때. 가장 경제적 인 방법은 하류 프라이머가 스플 라이스 조인트를 통과하도록하는 것입니다. 이를 통해 프로브가 가능한 스플 라이스 변이를 감지 할 수 있습니다. 그런 다음 유효성과 민감성을 보장할 수 없는 경우 개별 외현자에 걸쳐 있는 설계 시나리오를 사용할 수 있습니다. 우리는 여전히 실험자들이 DnaseI 로 샘플을 처리하여 gDNA 오염을 제거할 것을 건의한다.
6. RT 단계에서 도구를 사용하여 특정 온도에서 대상 시퀀스의 접기를 감지하여 프로브와 프라이머 간의 결합 효율이 낮은 보조 구조가 높은 영역을 방지합니다.